实验名称：超声激活血卟啉对S180肿瘤细胞表面EGFR表达量的影响

　　研究方向：生物医疗

　　测试目的：

血卟啉是从血红蛋白中提取的有机光敏剂，其本身无抗肿瘤效应，但它可以在动物和人的多种肿瘤组织优先聚集，易为声光辐射处理激活，当它被声光激活后能产生强烈的抗肿瘤效应。美国利用光激活治疗肿瘤，这种方法被称为光动力学疗法，简称PDT。光动力学疗法在临床主要应用于人体表面浅层肿瘤的治疗。光在生物组织中的穿透能力差，使其对深部肿瘤的治疗受到限制。超声联合血卟啉对小鼠移植肿瘤生长抑制有协同效应，发现单用血卟啉无抑制作用，单用超声仅有轻微抑制作用，而两者联合则有明显的抑制效果，并将之命名为声动力学疗法。超声是一种弹性机械波，其在生物组织中的穿透能力比激光强，同时超声能够聚焦于特定部位。声动力疗法对于治疗肿瘤细胞有较强的针对性，对正常组织无创伤，组织穿透力强，并且机体不产生耐受性，可以反复多次治疗，因而它对于治疗肿瘤，特别是组织深层肿瘤有着较好的应用前景。有学者认为SDT杀死或抑制肿瘤细胞的部分机理是通过超声的热效应来实现的，但是大量的实验结果提示，SDT可能更主要地与超声激活聚集在癌组织的血卟啉产生单线态氧有关。

　　测试设备：ATA-8202射频功率放大器、昆明系小白鼠、艾氏腹水肿瘤细胞系、超声探头、血卟啉衍生物为单羟乙基单乙烯基次卟啉、细胞色素c和Bax单克隆抗体、caspase-3单克隆抗体、链霉卵白素SP试剂盒。

　　实验过程：

　　接种：S180腹水瘤细胞于6只小鼠腹腔1周后，随机取3只小鼠，抽取腹水细胞，分别置于医用薄壁试管，加入RPMI1640+10%小牛血清培养基中，于37℃孵箱培养，实验时用生理盐水调整细胞浓度至2x10⁶个/ml。每只小鼠抽取的腹水细胞分为12管，分为四组，分别为对照组(CT)、血卟啉组(H)、超声组(U)和超声加血卟啉组(UH)，每组三管，每管0.5ml细胞悬液。H组和UH组每管中加入血卟啉4ul，使其终浓度为0.01mg/ml，37℃CO₂孵箱孵育，45min后U组和UH组分别在频率为1.8MHz，强度为2W/cm²的超声装置中声照处理3min，各实验组分别于声照后1h、3h、5h取材，常规细胞涂片。

　　免疫组织化学染色：以SP法进行免疫组织化学染色：细胞涂片固定后加3%过氧化氢处理15min，除去内源性酶PBS洗3次，加正常动物血清30min以减少非特异性染色，加EGFR一抗4℃过夜，PBS代替一抗作为阴性对照。SP染色按试剂盒说明进行，DAB显色，梯度酒精脱水，中性树胶封固盖片。

　　阳性结果观察：各组随机选取10个高倍视野，利用数码显微成像系统进行图像采集和分析。Image Pro-Plus5.0图像分析软件测定各组照片的平均光密度OD值(0~255)(用平均光密度表示阳性细胞表达强度，平均光密度值越大则表达越强)。组间t检验显示组间差异。

　　实验结果：

　　由表中数据可以看出，超声激活血卟啉处理1h后，UH组、U组平均光密度值明显低于CT组、H组，且UH组平均光密度值低于U组，经组间t检验，UH组与其它组差异极显著(p<0.01)；超声激活血卟啉处理3h后，UH组平均光密度值小幅度下降，CT组、H组基本无变化，U组平均光密度下降，经组间t检验，UH组与可组差异显著(P<0.05)；UH组与CT组、H组差异极显著(p<0.01)；超声激活血卟啉处理5h后，UH组平均光密度值下降，其它组基本无变化，UH组与其它组差异极显著(p<0.01)(表1)。由图可知，UH组、U组平均光密度值明显低于H组和CT组，随时间延长U组、UH组变化显著。

　　表1EGFR在超声处理1h、3h、5h后平均光密度值比较(*10^-2)

　　图1EGFR在超声处理1h、3h、5h后平均光密度值比较(*10^-2)

　　JN江南sportsATA-8202射频功率放大器：

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