实验名称：超声实现离体H-22肿瘤细胞快速磁性标记研究

　　研究方向：生物医学

　　测试目的：

　　细胞磺性标记所采用的标记物多为超顺磁氧化铁(SPIO)纳米微粒，由于细胞膜表面和SPIO表面都带负电荷，二者相互排斥，细胞在自然状态难以摄取氧化铁颗粒。为提高细胞标记率，达到磁性标记细胞的目的，一般都是通过载体或转染剂对颗粒表面进行修饰，通过吞噬、液相胞饮等作用促进细胞对它们的摄取。近年还有人将磁性粒子与抗体和受体结合，通过细胞表面相应的受体使磁性粒子与细胞结合并进入细胞内。还可将磁性氧化铁粒子制成特定的标记物，通过哺乳类动物细胞非特异性膜表面吸收过程进入细胞内，用SPIO对目标细胞标记时，将SPIO与与转染试剂通过一定方式复合，然后与目标细胞一起放入培养基中共同培养，一般需要较长的孵育时间(24一48h)。SPIO微粒通过非特异性膜表面吸收过程进入细胞内。

　　葡聚糖包被的超小型超顺磁纳米粒子是目前应用最为广泛的磁共振成像对比剂，最早被用于体外细胞磺性标记试验。但相比于标准尺寸(50-150nm)或微米级的氧化铁微粒对比增强效果也较弱。使用体积大些的葡聚糖包被的SPIO标记细胞时胞质内Fe颗粒较颗粒小者多，标记效果好。另外，用大尺寸的如微米级尺寸的氧化铁微粒可实现对单个细胞的磁标记进而实现单细胞的磁共振成像。这也是目前一个崭新的研究方向，但由于细胞膜的保护作用，如何将这些大尺寸的氧化铁微粒加载进入细胞质中是一个有待解决的问题。

　　测试设备：ATA-8202射频功率放大器、信号发生器、超声探头、水槽、蒸馏水等。

　　实验过程：

　　利用化学共沉淀法自行合成葡聚糖包被的超顺磁纳米氧化铁水基磁悬液，其核心颗粒直径10~20nm，浓度可以根据需要自行调整。在此之前，曾经采用生化孵育的安全质量分数为25ug/mL且在输出电功率1W的条件下进行了装载实验，发现作用时间在2min以内该功率的超声对细胞活性几乎没有影响，但由于细胞悬液中SPIO微粒浓度太小，装载效果不理想。所以本次实验选用较大的SPIO浓度，按其在细胞悬液中的最终浓度分为A、B、C、D、E5组，各组质量分数为分别为22.5、90、410、1500、2250ug/mL且使超声发生器输出电功率为2W时进行超声装载实验，实验装置如图：

图1：实验装置

　　实验结果：

　　本次实验考察当探头激励频率1.43MHz，发生器输出电功率2w，细胞悬液中所含SPIO质量分数在22.5~2250ug/mL，，超声作用时间在10~120s条件下，细胞标记情况及活性。

　　1、细胞标记结果

　　普鲁士蓝显示阳性的为已标记的细胞，当SPIO在细胞悬液中质量分数为410ug/mL，超声发生器输出电功率为2w，探头中心频率1.43MHz，超声作用10s时H-22细胞的标记效果，细胞阳性率约为82%。而未经超声处理的细胞悬液，将其与纳米超顺磁氧化铁水基磁悬液一起在37℃孵育箱中孵育30min，然后用普鲁士染色，光镜下观察，几乎没有细胞被标记，可见不经超声处理，仅进行短时间孵育细胞是不能实现细胞标记，也就是说在没有超声的参与情况下，短时间内SPIO微粒不能够进入细胞内。证明超声作为一种外界力量确实可以使大颗粒物质一纳米氧化铁微粒进入细胞，实现细胞磁性标记。

为了研究细胞的标记率与超声处理时间、SPIO浓度之间的量化关系，在声学条件为1.43MHz，输出电功率为2W时，对不同的超声处理时间、SPIO浓度条件下，任取10个显微视野进行计数，统计SPIO对细胞的标记率。统计结果显示不同SPIO浓度时细胞标记率(%)与超声处理时间t(s)之间的关系如图2。

图2不同SPIO浓度时超声辐射时间与细胞标记率之间的关系

　　特定SPIO浓度时，标记率和超声作用时间的关系：当SPIO质量分数为22.5ug/mL时，随着超声作用时间增长，细胞标记率近似直线提高，但从整体来看，细胞标记率较低，当超声作用时间为120s时，标记率不足25%。当加入的SPIO质量分数为90~2250ug/mL时，标记率和超声作用时间呈现振荡关系。除410ug/mL外，超声作用时间低于30s，随时间延长标记率下降。30~60s之间，随时间延长，标记率提高；60s后，随时间延长，标记率又呈下降趋势。

超声作用时间一定，标记率和SPIO浓度间关系，从整个标记结果来看，超声作用时间在60s内，细胞标记率相对较高，超过60s后，标记率基本都在下降。当超声作用时间为30s，SPIO质量分数为410ug/mL(C组)，细胞标记率超过90%，SPIO质量分数过高(如1500ug/mL(D组)和2250ug/mL(E组))或质量分数过低(如22.5ug/mL(A组))细胞标记率均不足20%；说明SPIO在对H-22细胞标记时存在一个最佳浓度，浓度过高或过低，都会使标记效果变差。

　　标记率与SPIO质量分数、超声作用时间之间确切关系还需进一步研究。

　　JN江南sportsATA-8202射频功率放大器：

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